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抗體的發(fā)現(xiàn)

抗體藥物是生物技術(shù)制藥領(lǐng)域的一個(gè)重要方面�？贵w藥物的發(fā)展并不是一蹴而就的，抗體的發(fā)現(xiàn)以及抗體藥物的臨床應(yīng)用經(jīng)歷了一段漫長(zhǎng)的歷史進(jìn)程。

抗體治療的最早應(yīng)用可以追溯到中國(guó)人接種“人痘”預(yù)防天花的記載算起，國(guó)際上一般公認(rèn)的人痘接種術(shù)最早起源于中國(guó)公元１０世紀(jì)，但據(jù)中國(guó)的一些史書記載，種痘始于唐朝。１６６１年，隨著因得過(guò)天花而繼承皇位的康熙執(zhí)政，人痘接種開始從民間走進(jìn)皇宮，種痘術(shù)開始在全國(guó)得以提倡和推廣。到后來(lái)的英國(guó)人Jenner受到中國(guó)人痘接種法的啟示，接種牛痘預(yù)防天花，直至今日，免疫學(xué)的發(fā)展已有三個(gè)半世紀(jì)。

照片為我國(guó)為邊境少數(shù)民族孩子種痘，圖片來(lái)源于網(wǎng)絡(luò)。

早在19世紀(jì)末，抗體被動(dòng)免疫療法的創(chuàng)立為當(dāng)時(shí)不發(fā)達(dá)的疾病治療開辟了新途徑。Ehrlich提出的側(cè)鏈學(xué)說(shuō)為免疫學(xué)與免疫療法奠定了基礎(chǔ)。19世紀(jì)80年代后期，學(xué)者們?cè)谘芯坎≡倪^(guò)程中，發(fā)現(xiàn)白喉?xiàng)U菌分泌的白喉外毒素有致病性，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)在感染者的血清中有“殺菌素”(bactericidins)，這就是最早發(fā)現(xiàn)的抗體。

在抗體發(fā)現(xiàn)早期，這種特異性的抗體物質(zhì)勾起了科學(xué)家們極大的興趣，科學(xué)家們前赴后繼致力于解析抗體的結(jié)構(gòu)，但由于落后的實(shí)驗(yàn)條件，進(jìn)展緩慢。

1937年瑞典物理學(xué)家Arne Wilhelm Kaurin Tiselius通過(guò)電泳技術(shù)證明了抗體也是一種蛋白質(zhì)，并將其稱為γ球蛋白。

1953年英國(guó)生物化學(xué)家Frederick Sanger成功解析了同樣身為蛋白質(zhì)的胰島素的化學(xué)結(jié)構(gòu)，從而為科學(xué)家們解析抗體結(jié)構(gòu)指明了方向。

1963年，Edelman與RodneyRobert Porter(Sanger的第一個(gè)博士研究生)結(jié)合兩人多年的研究結(jié)果，提出了比較成熟的“Y”型對(duì)稱結(jié)構(gòu)的抗體分子模型。

1969年，Edelman和Porter完成了一項(xiàng)在當(dāng)時(shí)了不起的成就，他們成功對(duì)抗體1300多個(gè)氨基酸序列進(jìn)行了測(cè)定，是當(dāng)時(shí)測(cè)定氨基酸序列的最大的蛋白質(zhì)分子。

在Edelman提出的抗體多樣性理論的基礎(chǔ)上，1976年，日本科學(xué)家利根川進(jìn)和同事在檢測(cè)不產(chǎn)生抗體的胚胎細(xì)胞和產(chǎn)生抗體骨髓瘤細(xì)胞中抗體輕鏈基因的分布時(shí)發(fā)現(xiàn)，胚胎細(xì)胞中不同抗體基因距離較遠(yuǎn)，而骨髓瘤細(xì)胞中抗體基因距離接近，這個(gè)發(fā)現(xiàn)說(shuō)明生殖細(xì)胞在發(fā)育成免疫細(xì)胞的過(guò)程中，抗體基因發(fā)生了重新分布現(xiàn)象。利根川進(jìn)在此基礎(chǔ)上用一系列確鑿的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)確定了抗體多樣性是由B淋巴細(xì)胞中抗體基岡的染色體重排和突變?cè)斐傻�。根�?jù)估算，抗體基因通過(guò)重組和突變甚至可以編碼100億種不同的抗體，很好解釋了抗體多樣性產(chǎn)生的原因。1987年，利根川進(jìn)由于抗體多樣性的突破性研究獨(dú)享了該年度的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。

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抗體的類型

抗體重鏈類型直接決定了抗體的類型，哺乳動(dòng)物抗體重鏈可分為五類，分別以希臘字母γ、α、μ、δ、和ε表示，據(jù)此將抗體相應(yīng)地分為IgG、 IgA、 IgM、IgD和IgE。α和γ大約含有450個(gè)氨基酸，μ和ε約含550個(gè)氨基酸；同時(shí)μ鏈和ε鏈含有5個(gè)肽環(huán)，γ鏈、α鏈、δ鏈含有4個(gè)肽環(huán)。

IgG是血清中一種主要的Ig，含量占總Ig的65—75%左右。廣泛分布于組織液中，血管內(nèi)、外間隙中分布量大體相當(dāng)。是機(jī)體抗感染的一種重要物質(zhì)。

IgM是成熟胎兒合成的第一類Ig，也是在感染或免疫后最早產(chǎn)生的Ig，5類Ig中IgM最強(qiáng)，故其細(xì)胞毒活性和細(xì)胞溶解活性也最強(qiáng)。天然的血型抗體是IgM，有些自身抗體如抗磷脂抗體、RF等也屬于IgM。胎兒臍血中IgM抗體升高，是胎兒遭受感染的標(biāo)志。

IgA在血清和組織液中的含量相對(duì)較少，血清型IgA含量占總Ig的15—25%，但在外分泌液如初乳、唾液、眼淚、腸道分泌液和支氣管分泌液中含量較高。由于IgA主要存在于外分泌液中，故在第一線抗感染防御中起重要作用。

IgE為單體結(jié)構(gòu)，是正常人血清中含量最少的Ig。IgE在血清和組織液中含量極微，其主要生物學(xué)功能是與組織肥大細(xì)胞、嗜堿粒細(xì)胞表面的特異受體結(jié)合。IgE不能激活補(bǔ)體。IgE含量在正常人群波動(dòng)較大，在特異性過(guò)敏反應(yīng)和寄生蟲早期感染患者血清中可升高。當(dāng)變態(tài)反應(yīng)原與結(jié)合在受體上的IgE反應(yīng)時(shí)，可引起肥大細(xì)胞、嗜堿粒細(xì)胞脫顆粒，釋放出組織胺、5—羥色胺等生物活性物質(zhì)。

IgD在正常人血清中IgD濃度很低，幾乎檢測(cè)不到。IgD主要存在于人B淋巴細(xì)胞表面作為抗原的細(xì)胞受體，在血清中IgD含量極微且與膜結(jié)合的IgD有不同結(jié)構(gòu)。B細(xì)胞上IgD的可變區(qū)與該細(xì)胞將分泌的IgG、IgA、IgM的可變區(qū)相同，當(dāng)抗原與IgD受體結(jié)合時(shí)，刺激B細(xì)胞繁殖、分化、并分泌對(duì)抗原特異的其他類抗體

哺乳動(dòng)物抗體輕鏈大約由211–217個(gè)氨基酸殘基組成，共有兩型：kappa(κ)與lambda(λ)，同一個(gè)天然Ig分子上輕鏈的類型總是相同。但在同一個(gè)體內(nèi)可存在分別帶有κ或λ鏈的抗體分子。不同種屬生物體內(nèi)兩型輕鏈的比例不同，正常人血清免疫球蛋白κ鏈：λ鏈約為2：1，而在小鼠的比例為20：1。其他低等脊椎動(dòng)物中存在iota （I）亞型輕鏈，如軟骨魚類和真骨魚類。

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抗體的結(jié)構(gòu)

免疫球蛋白Ig由4條多肽鏈通過(guò)鏈間和鏈內(nèi)二硫鍵連接組成：兩條相同的相對(duì)分子質(zhì)量較大的肽鏈（稱為重鏈，heavychain，H鏈，相對(duì)分子質(zhì)量約為55000或70000）和兩條相同的相對(duì)分子質(zhì)量較小的肽鏈（稱為輕鏈，light chain，L鏈，相對(duì)分子質(zhì)量約為24000）組成。讓我們把抗體想象成在人的血液里飄浮著的成千上萬(wàn)個(gè)雙齒的小叉。每個(gè)小叉的每個(gè)齒都可以黏結(jié)一個(gè)特定抗原的一個(gè)特定部位，這樣一個(gè)雙齒叉可以結(jié)合兩個(gè)同樣的抗原�？乖瓌t可以是外來(lái)或病變的蛋白，甚至包括入侵病原體（真菌、細(xì)菌、病毒等）的RNA、DNA或多聚糖。

1.可變區(qū)（Variable Region，V區(qū)）

抗體小叉與小叉之間在結(jié)構(gòu)上的主要差異是位于齒端的可變區(qū)——這些可變區(qū)決定著抗體的抗原特異性。H鏈可變區(qū)約含118個(gè)氨基酸殘基和L鏈可變區(qū)約含108~111個(gè)氨基酸殘基�？勺儏^(qū)是抗體結(jié)合抗原的位置，其氨基酸的組成和排列決定抗體的抗原結(jié)合特異性。可變區(qū)存在一些氨基酸能夠高頻變化組合的區(qū)域，這些區(qū)域稱為超變區(qū)(hypervariable region，HVR)，超變區(qū)又稱為互補(bǔ)決定區(qū)（complementarity-determining region, CDR），超變區(qū)決定了抗體的獨(dú)特型（抗獨(dú)特型抗體表達(dá)）�？勺儏^(qū)中非HVR部位的氨基酸組成和排列相對(duì)比較保守，稱為骨架區(qū)（framework region，F(xiàn)R區(qū)）。VL中的CDR有三個(gè)，通常分別位于第24~34，89~97位氨基酸殘基，其中CDR3超變程度更高，抗體的特異性和親和力成熟主要涉及到該區(qū)域的改造。

2.恒定區(qū)（Constant Region， C區(qū)）

抗體小叉的柄部由一系列氨基酸序列基本不變的區(qū)域組成——我們稱之為恒定區(qū)。恒定區(qū)可以與細(xì)胞表面受體或補(bǔ)體系統(tǒng)蛋白相互作用，從而觸發(fā)宿主效應(yīng)功能（effector function)，比如裂解入侵細(xì)胞或吞噬外來(lái)病原�？贵w恒定區(qū)域位于H鏈靠近C端的3/4或4/5(約從119位氨基酸至C末端) 和L鏈靠近C端的1/2(約含105個(gè)氨基酸殘基)區(qū)域�？贵w重鏈恒定區(qū)分為CH1，CH2和CH3，其中CH3區(qū)域涉及到細(xì)胞膜表面受體結(jié)合，CH2涉及補(bǔ)體激活途徑，是補(bǔ)體結(jié)合位點(diǎn)。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，叉齒負(fù)責(zé)識(shí)別抗原，而叉柄則幫助宿主決定如何處置抗原。

3. 抗體Fab段和Fc段

IgG經(jīng)木瓜蛋白酶酶切后裂解為2個(gè)完全相同的Fab段和1個(gè)Fc段,每個(gè)Fab段都為單價(jià),可與抗原結(jié)合但不會(huì)再發(fā)生凝集反應(yīng)；經(jīng)胃蛋白酶酶切后裂解為1個(gè)完整F(ab)2片段和碎片化的Fc片段,F(ab’)2片段為雙價(jià),可同時(shí)結(jié)合兩個(gè)抗原表位。Fab段為抗原結(jié)合片段（fragment of antigen binding，F(xiàn)ab），相當(dāng)于抗體分子的兩個(gè)臂，由一個(gè)完整的輕鏈和重鏈的VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成。Fc段為可結(jié)晶段（fragmentcrystallizable，F(xiàn)c）相當(dāng)于Ig的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域，是Ig與效應(yīng)分子或者細(xì)胞相互作用的部位。Fab段包含完整的可變區(qū)，以及恒定區(qū)的CH1區(qū)域。Fc段僅指Ig恒定區(qū)CH2和CH3的區(qū)域，相當(dāng)于Y字結(jié)構(gòu)下面那一部分。

4. 重鏈抗體的結(jié)構(gòu)

駱駝?lì)惡蛙浌囚~類中天然缺失輕鏈的抗體又被稱為重鏈抗體，存在于亞洲的西亞駱駝（Camelusbactrianus）、非洲的單峰駝（C.dromedarius）和南美的大羊駝（Lama glama）、原駝（L.guanicoe）、羊駝（Vicugna pacos）和小羊駝（V.vicugna）等駱駝科中。

1995年又在護(hù)士鯊（Ginglymostoma cirratum）、斑紋須鯊（Oretolobus maculatus）、銀鮫等軟骨魚中發(fā)現(xiàn)了無(wú)輕鏈或其他蛋白分子伴隨的類似于重鏈抗體的抗原受體（new or nurse shark antigen receptor，NAR）。由于NAR分子與Ig亞型在跨膜和分泌方式等幾個(gè)功能特征方面近似，因此也被稱為免疫球蛋白新抗原受體（Ig new antigen receptor，IgNAR）。重鏈抗體具有廣泛應(yīng)用價(jià)值的是單域重鏈抗體（single domainantibody，sdAb）部分。單域重鏈抗體是指僅由重鏈抗體可變區(qū)（Variable region）組成的基因工程抗體，又稱為VHH抗體（variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody，VHH antibody）或納米抗體（Nanobody，Nb），分子量為12-15 kD。

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治療性抗體的發(fā)展階段

自1986年第一個(gè)治療性抗體進(jìn)入臨床以來(lái)，治療性抗體得到了迅速的發(fā)展，到目前為止，F(xiàn)DA共批準(zhǔn)了近百個(gè)治療性抗體藥物，其已成為現(xiàn)代生物醫(yī)藥的重要組成部分。伴隨現(xiàn)代科技的發(fā)展，治療性抗體經(jīng)歷了鼠源性抗體，嵌合抗體，改性抗體和表面重塑抗體（部分人源化抗體），以及全人源化抗體等不同發(fā)展階段。 

第一代：鼠源單抗（momab）

1986年，也就是在Milstein和Kohler憑借單抗雜交瘤技術(shù)獲得諾貝爾獎(jiǎng)后的第二年，強(qiáng)生的Orthoclone  OKT3成為第一個(gè)被美國(guó)FDA批準(zhǔn)的單抗藥，用于防止腎臟移植后的宿主排斥。但直到9年以后，第二個(gè)抗體藥——禮來(lái)和強(qiáng)生的ReoPro——才于1995年在美國(guó)上市，被用來(lái)抑制血栓形成。 

第一個(gè)單克隆抗體藥Orthoclone  OKT3來(lái)自于小鼠，它的氨基酸序列都是鼠源的。鼠源抗體在給病人服用過(guò)程中常常遇到一些問題：1）人體把這些單抗藥當(dāng)作異體蛋白，會(huì)產(chǎn)生免疫排斥。2）免疫排斥使單抗藥很快從病人體內(nèi)被清除掉，大大降低了它們應(yīng)有的療效。尤其治療慢性疾病需要長(zhǎng)期服用的情況下，鼠源單抗藥在后續(xù)注射時(shí)療效甚微；3）少數(shù)病例中，鼠源抗體會(huì)引起嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)，甚至導(dǎo)致了個(gè)別病人的死亡。因此，早期單抗藥的銷售始終沒有騰飛——Orthoclone OKT3的年銷售額僅有1千萬(wàn)美元左右。

單抗藥要想在江湖上立足，要想在醫(yī)學(xué)上有更廣泛的應(yīng)用，必須要轉(zhuǎn)變成人源化抗體或人源抗體。

第二代：人鼠嵌合單抗（ximab）和人源化單抗（zumab）

這里我們有必要區(qū)分一下人源化抗體和人源抗體。人源化抗體一般是以鼠源抗體為基礎(chǔ)，通過(guò)更換蛋白片斷和置換部分氨基酸序列， 使抗體的最終氨基酸序列更接近人源的。而人源抗體是任何能被人體B細(xì)胞表達(dá)的抗體，其氨基酸序列是100%由人的基因編碼的。

20世紀(jì)90年代，以美國(guó)為主出現(xiàn)了幾十家生物技術(shù)公司。他們個(gè)個(gè)身懷絕技——他們的技術(shù)平臺(tái)都是圍繞如何將抗體人源化或直接產(chǎn)生人源抗體而建立的，他們的目的都是將抗體藥發(fā)揚(yáng)光大。以研發(fā)抗體藥為主的公司在當(dāng)時(shí)的江湖上分兩大流派。第一個(gè)流派可以稱之為抗體蛋白工程派或人源化派。單抗在小鼠中產(chǎn)生后，它的部分氨基酸序列或被置換，或被拼接組合，其最終目的是既不引起人的免疫排斥，又不降低它對(duì)靶抗原的親和性。這一流派又分為兩個(gè)層次。第一個(gè)層次是嵌合抗體（Chimeric  antibody）:  抗體的恒定區(qū)都被置換成人的氨基酸序列。嵌合單抗蛋白約33%的氨基酸序列來(lái)自小鼠，其余67%為人源的。第二個(gè)層次是人源化抗體(Humanized antibody)，即拿到針對(duì)某抗原的小鼠抗體后，只取其識(shí)別抗原的幾段區(qū)域（CDR區(qū)域），把它們移植到人源抗體中。人源化單抗中人源的序列占90%。人源化單抗顯然比嵌合單抗更有優(yōu)勢(shì)，引起免疫排斥或超敏的風(fēng)險(xiǎn)更低。人源化單抗技術(shù)的代表公司為Protein Design Labs, 或PDL�；蛱┛藥讉�(gè)著名的單抗藥——Herceptin, Xolair和Avastin——的人源化都需要獲得PDL的技術(shù)許可。人源化單抗技術(shù)最大的缺點(diǎn)是缺乏通用的方法。每個(gè)抗體分子的人源化，都需要個(gè)案分析、分子建模、大量的改造和試錯(cuò)。即使這樣，由于鼠源序列的存在，人源化單抗還是不能完全避免免疫排斥或超敏的風(fēng)險(xiǎn)。

第三代：全人源化單抗（mumab）

抗體藥的第二個(gè)流派是全人源單抗。這一流派又分為兩大門派：噬菌體展示和轉(zhuǎn)基因小鼠。

用噬菌體展示技術(shù)產(chǎn)生抗體完全避免了動(dòng)物的使用。在這一技術(shù)中，先通過(guò)PCR技術(shù)建立一個(gè)以噬菌體質(zhì)粒為載體的、表達(dá)無(wú)數(shù)個(gè)人源抗體可變區(qū)的基因庫(kù)。當(dāng)大腸桿菌被這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，千百萬(wàn)個(gè)噬菌體被釋放出來(lái)。每個(gè)噬菌體表面呈現(xiàn)一個(gè)獨(dú)特的抗體可變區(qū)片斷。含有這些噬菌體混合物的溶液，在流過(guò)附著特定抗原的固態(tài)基質(zhì)后，粘在基質(zhì)表面、洗不走的往往是呈現(xiàn)特異性抗體的噬菌體顆粒。特異性抗體的基因再進(jìn)一步被擴(kuò)增、純化。這一流派的代表公司包括CAT和Dyax。

轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)出道雖晚，但技術(shù)優(yōu)勢(shì)卻最為明顯。該技術(shù)通過(guò)轉(zhuǎn)基因的手段把小鼠自身的抗體表達(dá)系統(tǒng)破壞掉，再引進(jìn)人的抗體生成系統(tǒng)。這種轉(zhuǎn)基因小鼠針對(duì)某種抗原就可以直接產(chǎn)生全人源的抗體。

噬菌體展示和轉(zhuǎn)基因小鼠在執(zhí)行過(guò)程中各有千秋。一般來(lái)說(shuō)，噬菌體展示技術(shù)“先快后慢”，即找到針對(duì)某種靶蛋白的抗體很快，但選出的這個(gè)抗體和靶蛋白的親和性往往不高，需要人工細(xì)調(diào)，更換個(gè)別氨基酸。優(yōu)化這一步費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且即使優(yōu)化的抗體和通過(guò)轉(zhuǎn)基因小鼠出來(lái)的抗體相比，親和力可能還是相差一個(gè)數(shù)量級(jí)。另外，在優(yōu)化的過(guò)程中需要替換一些氨基酸，也就引進(jìn)了被免疫排斥的風(fēng)險(xiǎn)。轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)是“先慢后快”，將抗原注射到小鼠體內(nèi)、產(chǎn)生特異抗體、制備雜交瘤細(xì)胞等前幾步需要幾個(gè)月的時(shí)間。但一旦最初的抗體產(chǎn)生，其優(yōu)化過(guò)程在小鼠體內(nèi)繼續(xù)完成，又快又好，并且不用擔(dān)心免疫排斥的問題。

在這里要不得不提到全球第一個(gè)上市的全人源抗體—阿達(dá)木單抗（修美樂）。阿達(dá)木單抗始于1993年巴斯夫子公司BASF Knoll和劍橋抗體技術(shù)公司(Cambridge Antibody Technology，CAT)的合力研究。劍橋抗體技術(shù)以TNFα為抗原使用它們特有的噬菌體展示技術(shù)在體外篩選中得到了全人抗體D2E7。在隨后的研究中，BASF Knoll進(jìn)一步對(duì)全人抗體D2E7進(jìn)行了完善，并完成了前期的生產(chǎn)工藝開發(fā)和臨床申報(bào)。

2002年6月，美國(guó)雅培制藥（Abbott）以69億美元收購(gòu)BASF Knoll，獲得了全人抗體D2E7的開發(fā)生產(chǎn)和銷售權(quán)，最終將阿達(dá)木單抗推向市場(chǎng)。自2002年首次獲得FDA批準(zhǔn)上市以來(lái)，阿達(dá)木單抗已經(jīng)累計(jì)創(chuàng)造了1161億美元的銷售收入，2017年的美國(guó)市場(chǎng)增速為18.5%，全球市場(chǎng)增速為14.6%，因此直到今天仍然以每年兩位數(shù)的增幅刷新單只藥品的年度銷售記錄。 

小結(jié)

抗體藥物從發(fā)現(xiàn)到進(jìn)入臨床應(yīng)用，經(jīng)歷了曲折而又漫長(zhǎng)的歷程。在這段時(shí)間里，人們對(duì)于抗體藥物的認(rèn)識(shí)發(fā)生了巨大的變化。在過(guò)去的十年里，抗體已經(jīng)成為醫(yī)藥市場(chǎng)上最暢銷的藥物。預(yù)估 2021 年全球十大暢銷的藥物中，就會(huì)有 5 個(gè)抗體類藥物。因此，隨著抗體類藥物被批準(zhǔn)用于治療各種包括癌癥、自身免疫、代謝和傳染病，治療性抗體藥物的市場(chǎng)必會(huì)呈現(xiàn)爆炸式增長(zhǎng)的態(tài)勢(shì)。